Статья «MILDEW RESISTANCE LOCUS O GENE CLONING, CHARACTERIZATION, AND EXPRESSION PATTERN IN MULBERRY AND ITS PROKARYOTIC EXPRESSION IN E. coli, "Биоорганическая химия"»

Клонирование, характеристика и паттерн экспрессии гена устойчивости к плесени локуса О шелковицы (Morus multicaulis) и его экспрессия в прокариотической системе E. coli. Локус устойчивости к плесени О (MLO, от англ. mildew resistance locus O), который кодирует семиспиральный трансмембранный белок, считается модельным геном растений для изучения устойчивости широкого спектра. Он является отрицательным регулятором устойчивости к плесени и, таким образом, потенциально может использоваться в селекции растений. В данной работе полная последовательность кДНК, кодирующая ген MLO листьев шелковицы (Morus multicaulis), была клонирована с помощью экспрессируемых маркерных последовательностей (EST, от англ. expressed sequence tags) шелковицы, технологии гомологичного клонирования и метода быстрой амплификации 5 -концов кДНК c помощью РНК-лигазы (5-RLM-RACE, от англ. RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends) и ОТ-ПЦР; последовательность была названа MMLO и депонирована в базу данных GenBank под номером KX683296. Длина полной кДНК составила 1943 п.о., включая 5-нетранслируемую область (5-UTR) длиной 106 п.о. и 3- нетранслируемую область (3-UTR) длиной 160 п.о., а также открытую рамку считывания (ORF) длиной 1677 п.о., кодирующую белок из 558 аминокислот. Расчетная молекулярная масса и изо-электрическая точка (pI) предполагаемого белка 62.48 кДа и 9.03, соотв. Белок MMLO имеет в своем составе домен Mlo и принадлежит к суперсемейству Mlo. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей, кодируемых генами MLO разных видов, показал высокую степень родства между шелковицей и Eucalyptus grandis, Ziziphusjujube и Juglans regia. Количественная ПЦР в реальном времени показала, что MMLO экспрессируется во всех исследованных тканях, включая листья, почки, плоды, побеги, флоэму и ксилему шелковицы; при этом наивысший уровень экспрессии наблюдался во флоэме. Уровень экспрессии мРНК увеличивался и значительно менялся в условиях засухи, холода и солевого стресса по сравнению с нормальной ростовой средой. Рекомбинантная экспрессионная плазмида была получена путем вставки сегмента MMLO, соответствующего открытой рамке считывания, в экспрессионную плазмиду pET-28a(+). По данным электрофореза в денатурирующих условиях фьюжн-белок успешно экспрессировался. В целом результаты способствуют лучшему пониманию молекулярных основ передачи сигнала в условиях стрессовых реакций у шелковицы.