Статья «ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПЕПТИДОМНОГО АНАЛИЗА ПЛАЗМЫ КРОВИ1), "Биоорганическая химия"»

Оптимизированы условия пептидомного анализа плазмы крови и проведено сравнение эффективности предложенного подхода с описанными в литературе методами. При идентификации эндогенных пептидов плазмы крови перед исследователями возникают две основные задачи: как инактивировать содержащиеся в плазме крови протеазы и как отделить пептиды от мажорных белков плазмы крови, с которыми они прочно и количественно ассоциированы. Для решения этих задач нами предложен новый метод пробоподготовки. Суть метода заключается в денатурации белков плазмы крови дезоксихолатом натрия при нагревании в присутствии трис(2-карбоксиэтилфосфина) и 2-хлороацетамида, которые восстанавливают и ацилируют тиоловые группы Cys в белках. При денатурации белков дезоксихолатом натрия происходит также инактивация протеолитических ферментов и десорбция пептидов с поверхности белков. После отделения пептидов от белков ультрафильтрацией на микроцентрифужных фильтрах и удаления дезоксихолата натрия пептиды идентифицируют методом LC-MS/MS с использованием масс-спектрометра Q Exactive HF (Thermo Scientific). В результате одного LC-MS/MS-анализа пептидной смеси, полученной из ~15 мкл плазмы крови, было идентифицировано 2257 пептидных фрагментов 867 белков, что по количеству идентифицированных пептидов в 1.5 раза превышает показатели, достигнутые нами при использовании наиболее эффективного из описанных в литературе подходов - метода дифференциальной солюбилизации. В ближайшие наши планы входит использование разработанного нами подхода для каталогизации пептидов плазмы крови человека, а также установления величины межиндивидуальной вариабельности и связанных с полом и возрастом особенностей компонентного состава её пептидома.